Transformasi
genetik dengan menggunakan Agrobacterium merupakan sistem transformasi
genetik tidak langsung. Transformasi dengan Agrobacterium memiliki
beberapa keuntungan antara lain bersifat dapat diulang (reproducible),
relatif lebih murah, memberikan pola integrasi yang tegas, jumlah salinan dalam
genom sedikit (1-3 salinan). Selain menyisipkan gen target untuk perubahan
sifat tanaman tertentu yang dikehandaki, transformasi genetik dengan Agrobacterium
pada tanaman juga bermanfaat untuk membuat populasi tanaman mutan. Dengan
menggunakan Agrobacterium memungkinkan diperoleh mutan dalam jumlah
banyak dalam suatu periode yang relatif singkat.
Strategi
untuk memasukkan gen target ke dalam T-DNA dapat dilakukan dengan dua pendekatan.
Pertama dengan cara tidak langsung memasukkan gen dengan posisi cis (bersebelahan)
dengan gen virulen dalam plasmid yang sama dan dikenal dengan vektor
ko-integrasi. Pendekatan kedua dengan melakukan kloning gen ke dalam daerah
T-DNA di dalam plasmid yang berbeda yang dikenal dengan sistem vektor ganda. Masalah utama penyisipan DNA ke dalam plasmid
Ti adalah ukuran plasmid Ti yang besar (200 kb) dan daerah T-DNA pada umumnya
tidak memiliki sisi unik untuk pemotongan DNA. Besarnya ukuran ini menyulitkan
dalam manipulasi dan menentukan tempat pemotongan yang spesifik pada plasmid
Ti.
Agrobacterium sangat besar pengaruhnya dalam menghasilkan tanaman yang dimodifikasi
untuk mendapatkan sifat yang diinginkan (transgenik). Peran Agrobacterium dalam
hal ini ialah sebagai kendaraan pembawa gen (DNA) yang diinginkan.
Agrobakterium
tumefaciens merupakan bakteri aerob
obligat gram negatif yang hidup alami di tanah. Bakteri ini banyak menyebabkan
penyakit crown gall (tumor) pada tanaman dikotil. Kemampuannya dalam
menyebabkan penyakit ini berhubungan dengan gen penginduksi tumor yang ada pada
plasmid (Ti) yang dijumpai dalam bakteri tersebut. Dalam sel tumor yang
terbentuk terkandung enzim-enzim yang tidak tampak pada tanaman normal, karena
enzim tersebut hanya dihasilkan oleh sel Agrobacterium. Enzim-enzim
tersebut menghasilkan suatu senyawa gula spesifik yang dinamakan opin. Senyawa
opin ini merupakan makanan bagi Agrobacterium itu sendiri.
Aspek
molekuler yang mendasari transformasi genetik oleh Agrobacterium ialah
proses transfer DNA dari Agrobacterium ke dalam genom sel tanaman. Di
dalam sel Agrobacterium terdapat tiga komponen utama yang berperan dalam
transfer DNA ke dalam sel tanaman yaitu :
· Komponen pertama ialah suatu fragmen DNA yang dikenal sebagai
T-DNA, yaitu fragmen yang ditransfer ke dalam sel tanaman. T-DNA terdapat dalam
plasmid Ti yang berukuran 200 kb (kilo basa). Daerah T-DNA diapit oleh sekuen
DNA berulang yang berukuran 25 pb (pasang basa) pada sisi kanan dan kiri.
· Komponen
kedua ialah daerah virulence (vir) yang berukuran 35-40 pb dan berada
dalam plasmid Ti. Letak gen vir bersebelahan dengan batas kiri T-DNA.
Gen-gen vir ini terbagi atas 7 yaitu A, B, C, D, E, G dan H. Gen-gen vir
mensintesis protein virulensi yang berperan menginduksi terjadinya transfer
dan integrasi T-DNA ke dalam tanaman.
Empat gen-gen vir yang paling penting
mensintesis protein virulensi ini ialah vir A, B, D dan G. Jika ada
sesuatu yang menginduksinya, gen vir A dan G akan terekspresi dan
mengaktifkan serangkaian gen-gen vir lainnya. Senyawa kimia yang
diketahui sebagai penginduksi gen vir antara lain monosiklik fenolik
acetosyringone. Senyawa induser tersebut dihasilkan tanaman ketika tanaman
dikotil luka dan mengeluarkan getah. Ekspresi gen vir juga sangat
dipengaruhi oleh senyawa induser dan kondisi pH dimana pH optimum untuk
ekspresinya berkisar antara 5-5,8 (Hiei dkk, 1997).
· Komponen ketiga adalah gen chromosomal virulence (chv) yang
terdiri atas chvA, chvB, pscA dan att. Gen-gen
tersebut terletak di dalam kromosom Agrobacterium dan mempuyai fungsi
untuk pelekatan bakteri pada sel tanaman dengan membentuk senyawa protein
β-1,2-glukan. Berdasarkan sifat alamiah tersebut maka pada dua puluh tahun
terakhir Agrobacterium dijadikan media pembawa gen target tertentu
dengan cara menyisipkan gen target pada daerah T-DNA.
Sel
berwarna coklat adalah sel Agrobacterium dan warna hijau adalah sel
tanaman. Senyawa induser yang dikeluarkan tanaman saat luka akan mengaktifkan
gen vir A dan G untuk selanjutnya mengaktifkan gen-gen vir lainnya
sehingga proses transfer daerah T-DNA dari Agrobacterium ke dalam sel
tanaman terjadi.
